Expérimentation

Expérimentation

Depuis une quinzaine d'années, de nombreuses études ont permis le développement de nombreuses nanoparticules (NPs) fluorescentes semi-conductrices, métalliques, à base de silicium ou de polymères (Ruedas-Rama et coll, 2012). Fréquemment, les NPs sont rendues fluorescentes en incorporant des sondes de nature chimique variée (Sokolov et coll, 2007). Des études récentes ont montré également que la microscopie STED permettait d’étudier des NPs de diamant avec des propriétés de fluorescence intrinsèques (Rittweger et coll, 2009). Les applications de la microscopie STED sont à ce jour majoritairement dédiées aux domaines biologiques et biomédicales. Cependant Busko et coll, ont montré en 2012 que l'utilisation de la microscopie STED pouvait également avoir des applications dans les sciences des matériaux et ainsi offrir de nouvelles perspectives. De plus, la microscopie STED pourrait être une des approches d'imagerie permettant d'identifier les différentes NPs émises par des matériaux et donc d'apporter une aide pour contrôler les risques de toxicité. Dans sa globalité, la caractérisation des NPs peut ainsi permettre d’élaborer des stratégies de réduction des risques de santé publique en agissant directement à la source des émissions de NPs.

Démarche expérimentale

Préparation de l'échantillon:

Soit les NPs sont en solution et on les mélange avec un milieu de montage appelé Prolong Gold ( ). C'est le cas des fluosphères et des NPs de diamant. Une fois la solution préparée (60 µl de solution de NPs + 540 µl de Prolong Gold), elle est versée dans une boîte de Pétri dont le fond est une lamelle de verre de 0,17 mm d'épaisseur. On dépose ensuite délicatement une lamelle de verre sur la solution pour stabiliser le tout.

Soit les NPs sont déjà immobilisées entre une lame et une lamelle, c'est le cas des nanobilles d'or. On nettoie la lamelle en appliquant un mélange à base d’éther avec un papier spécial qualité optique pour éliminer toutes les impuretés.

Sélection en mode visuel:

1°) Positionnement de l'échantillon sur le microscope:

On place une goutte d'huile d'immersion sur l'objectif (x100) pour réaliser la mise au point. On place ensuite l'échantillon sur la platine du microscope inversé en faisant attention que la lamelle soit face à l'objectif. On ajuste la position de la platine grâce à un joystick afin que l’échantillon soit bien en face de l’objectif. On ajuste ensuite la hauteur de l’objectif jusqu'à ce que la goutte d’huile soit en contact avec l’échantillon.

Dans l’interface, on peut distinguer plusieurs modes :

Mode configuration : il permet de choisir l’objectif et le laser à utiliser.

Mode acquisition : il permet de choisir les capteurs à utiliser et d’activer les raies du laser qui seront utiles pour l’observation.

On peut régler le format de l’image (plus ou moins de pixels).

On peut régler la vitesse de balayage du laser.

Préparation d'un échantillon de fluosphères: on place les fluosphères dans un milieu liquide pour faciliter l'observation.

Statif inversé du microscope

par Victor GALAS

Pour apporter des éléments de réponse expérimentaux à notre problématique de TPE, nous avons réalisé des tests d'imagerie photonique à l'Université de Rouen sur des NPs modèles comme les nanobilles d'or (Abberior), les fluosphères (Molecular Probes) ou les nano-particules de diamant (Sigma Aldrich) avec Damien Schapman, un ingénieur en physique sur la plateforme PRIMACEN.

Fluosphères

Nanobilles d'or pour vérifier que le laser de déplétion est correctement aligné.

Nano-particules de diamant

Démarrage du système d'imagerie:

On met sous tension les différents modules tels que le module STED, le laser, la tête confocale, l'ordinateur avec le logiciel dédié ainsi que la source lumineuse pour l'observation en mode visuel.

Joystick de contrôle

Axe z

Axe x

Axe y

2°) Recherche des nanoparticules en mode visuel:

Dans un premier temps, on cherche les NPs sans utiliser l'ordinateur et le logiciel. Pour cela, on désactive la fonction "SHUTTER" pour laisser passer la lumière sur l’échantillon. Ainsi, on peut choisir les filtres d'excitation et d'émission que l'on souhaite utiliser. On cherche les nanoparticules en regardant par les oculaires et en déplaçant l’échantillon grâce au joystick (axes x et y). Une fois trouvées, on fait la mise au point en déplaçant l’objectif selon la hauteur (axe z). C’est une étape préparatoire pour s’assurer de bien cibler les nanoparticules.

Oculaires

Shutter

Régalage du logiciel:

Dans un second temps, on utilise un logiciel dédié (LAS X de LEICA) pour le microscope avec lequel on peut modifier tous les réglages du microscope et capturer des images de l'échantillon.

On définit également les bornes de détection pour collecter la lumière (longueur d'onde au nanomètre près) grâce à des filtres ajustables : c’est ce qu’on appelle la fente spectrale.

Acquisition d'images:

Pour obtenir une image de l’échantillon, on défini le nombre de pixels voulus puis on appuie sur la fonction "CAPTURE".

Imagerie de fluosphères en mode confocal et en mode STED:

La fluosphère mesure environ 247 nm.

La fluosphère mesure environ 62 nm.

Imagerie de nano-particules de diamant (taille théorique: 70 nm)

L'image n'est pas exploitable en raison d'une mauvaise préparation de l'échantillon (les NPs ne sont pas immobilisées).

Fiche techniques des nano-particules de diamant:

Analyse des images:

Grâce au logiciel, on peut déterminer la taille des nanoparticules et ainsi voir la différence de résolution entre le mode confocal et le mode STED. La taille théorique des fluosphères est de 48 nm. Fiche techniques des fluosphères:

Conclusion:

L'alignement du laser de déplétion a été corrigé grâce aux nanobilles d'or.
Les résultats sont satisfaisants pour les fluosphères avec une amélioration très significative de la résolution latérale en mode STED. Une amélioration est encore possible grâce à un logiciel d'analyse d'image qui utilise la déconvolution.
Un développement supplémentaire est nécessaire pour la détection des nano-particules de diamant.

Vérification de l'alignement du laser de déplétion :

Pour s'assurer que le laser de déplétion est correctement aligné, on réalise des tests en mode confocal (réflexion) avec les nanobilles d'or. Si le laser n'est pas correctement aligné, on peut le corriger en modifiant ses paramètres avec le logiciel.

Imagerie de nanobilles d'or en mode confocal (réflexion)

En vert,l'image d'une nanobille d'or d'une taille de 190 nm (excitation à 488 nm).

En rouge, le laser de déplétion en forme de donut (592 nm).

200 nm

Avant alignement

Après alignement

Taille théorique: 80 nm

Taille mesurée: 190 nm

Réf: Abberior - Gold Nanoparticules 80nm -Lot : 20130321

Excitation: 488 nm (laser blanc)

Emission: 500 à 540 nm

Déplétion: 592 nm

Excitation: 488 nm (laser blanc)

Emission: 500 à 540 nm

Déplétion: 592 nm