Microscopie STED

Microscopie STED

Le STED est un module d'amélioration de la résolution ajouté à un microscope (confocal dans notre cas). La technologie STED (STimulated Emission Depletion : Déplétion par émission stimulée) utilisé le plus souvent dans l’étude d’échantillons vivants, n’est disponible que dans quelques universités et laboratoires : il y en a moins d’une dizaine en France. Le système de microscopie STED fabriqué par Leica (constructeur Allemand réputé dans le domaine de la photographie et de l’optique) est une technologie inventée par Stephan Hell (qui a d’ailleurs obtenu le prix Nobel de Chimie 2014 pour la mise en place de cette technologie).

Stefen W. HELL, physicien allemand, co-lauréat du prix Nobel de chimie 2014.

par Mathis FERON

Présentation du système de microscopie de super-résolution STED

I°) Rappel du principe de microscopie confocal:

Le microscope confocal étant le microscope que nous avons utilisés avec la technologie STED, voici un petit rappel de son fonctionnement.

Premièrement, le statif du microscope confocal peut être droit (objectif au dessus de l’échantillon) ou inversé (objectif en dessous de l’échantillon). Celui sur lequel nous avons manipulé est un microscope inversé (le source de lumière blanche vient du dessus et le laser vient du dessous).

2°) Trajet de la source lumineuse:

Le laser blanc (1) est donc dirigé sur l’échantillon et le balaye à l’aide de miroirs galvanométriques (2). Ces miroirs bougent très vite afin de diriger le laser sur tout l’échantillon : on parle de "balayage laser", cela veut dire que le laser parcourt l’échantillon de gauche à droite puis de haut en bas. Une fois que l’échantillon est touché par le laser, il diffuse de la lumière par fluorescence (principe de fluorescence expliqué après). La lumière émise parcoure le même chemin que le laser en sens inverse et atteint un "pinhole" (trou d'épingle en français) (3). C'est un dispositif en forme de disque dont l’ouverture réglable permet de choisir la quantité de lumière voulue. Toujours dirigée par des miroirs, la lumière atteint un prisme (4) permettant d’éclater la lumière qui va finalement atteindre des capteurs (5).

Le détecteur hybride (HyD):

Il a une utilité similaire au photomultiplicateur mais une méthode différente. En effet, il convertit aussi des photons en signal en passant par une conversion photon/électron mais il combine deux techniques (d’où le nom d’hybride) : le photomultiplicateur et le détecteur par avalanche.

Le détecteur par avalanche étant un système qui au lieu d’utiliser des dynodes, procède à une amplification du nombre d’électrons par avalanche: les électrons circulent dans un matériau semi-conducteur et se multiplient en fonction de la tension.

Le détecteur hybride combine ces deux techniques: les photons sont convertis en électrons par la photocathode et sont projetés contre le matériau semi-conducteur dans le vide avec une puissance dépendant de la tension. Une fois dans le matériau, les électrons se multiplient et sont convertis en signal électrique par l’anode.

4°) Le principe de fluorescence:

La fluorescence c'est quand un atome possédant des propriétés fluorescentes absorbe un photon, ce qui excite l'atome et fera changer les électrons de couche électronique (vers les couches extérieures les plus éloignées du noyau). Quand les électrons redescendent et que l'atome redevient stable, un photon est émis.

On envoie de la lumière ou de l’énergie sur l’échantillon. Cette énergie excitera les électrons qui vont changer de couche électronique et produire de la lumière quand ils reviennent à leur couche électronique initiale.

II°) Principe de la microcopie STED:

L'image d'un point à travers un système optique est une tâche (on appelle ce phénomene PSF: point spread function soit fonction d'étalement du point). Le principe de la microscopie STED va permettre d’éliminer la fluorescence autour de l’échantillon en empéchant la fluorescence et ainsi l'image d'un point sera un point. La technologie STED permet donc de résoudre le problème de résolution.

1°) Source lumineuse:

La source de lumière utilisée sur ce microscope est le laser (différents types sont disponibles comme le laser infrarouge où ultraviolet mais celui principalement utilisé est le laser blanc contenant tout le spectre lumineux grâce à un supercontinuum).

1

2

3

4

5

3°) Les capteurs:

Il existe deux types de capteurs que l'on peut utiliser avec ce système. Les capteurs vont transformer les photons émis par l'échantillon en signal électrique. Le signal permet par la suite de créer une image avec un ordinateur disposant du logiciel adapté.

Le photomultiplicateur (PM):

Il convertie un photon en électron à l’aide d’une photocathode, ces électrons se répercutent sur des dynodes qui les multiplient, les électrons atteignent finalement l’anode, cela produit un signal électrique. On peut faire le lien avec la fonction « gain » de l’interface qui permet en augmentant la tension du photomultiplicateur, d’augmenter le signal.

Le principe de la microscopie STED repose sur le laser de déplétion, un laser d’une longueur d'onde de 592nm, permettant d’éliminer la fluorescence autour de l’échantillon en faisant redescendre de couche électronique les électrons ce qui n’entraîne donc aucune émission. Ce laser en forme de « donut » permet une image plus précise de l’échantillon.

1

2

3

1 : sans laser de déplétion

2 : laser de déplétion

3 : avec laser de déplétion